Как работают молекулярные биологи. Александр Панчин — «Сумма биотехнологии»

Попытайтесь догадаться, чем занимается человек, которого я сейчас опишу, учитывая, что его история основана на реальных событиях. Наш герой находился в городе на берегу океана, где он зашел в магазин, чтобы купить пачку презервативов и детектор поддельных банкнот. Обе покупки понадобились ему только ночью, когда он в кромешной темноте находился на яхте недалеко от берега. Вскоре на яхту взошел береговой патруль, чтобы проверить документы таинственной личности в связи с весьма подозрительной активностью оной и ее подельников. Документы оказались в порядке, и патрульные удалились восвояси. Назовем этого человека Доктором М.

Вы удивитесь, но Доктор М — молекулярный биолог, университетский профессор. Он ныряет под воду с аквалангом в поисках кораллов. Эти родственники медуз флуоресцируют при свете герметично упакованного в презерватив детектора валют. Из полученных образцов Доктор М выделяет ДНК, чтобы потом открыть новые гены флуоресцентных белков. Иногда, прежде чем прочитать ДНК, нужно ее поймать! В этом амплуа Доктор М выступает как настоящий «мокрый» биолог. Так на жаргоне называют ученых-экспериментаторов, противопоставляя их «сухим» биологам — теоретикам и биоинформатикам, которые работают с готовыми данными.

Чайники для полимеразной цепной реакции, презервативы и ультрафиолетовые лампы — это далеко не все подручные средства, помогающие двигать науку вперед. Рассмотрим способ выделения ДНК, для использования на кухне или в баре, в процессе которого получается неплохой побочный продукт — съедобный алкогольный коктейль. Выделять ДНК мы будем из клубники. Культивируемая клубника Fragaria ananassa приятна на вкус, и в то же время в ней немало ДНК. Размер генома клубники составляет 720 миллионов нуклеотидов, при этом Fragaria ananassa октоплоидная: каждая из семи хромосом представлена в клетках восемью копиями. Клубнику нужно поместить в морозилку, чтобы кристаллизация воды при образовании льда привела к разрушению клеток, а затем разморозить, чтобы содержимое клеток вытекло наружу.

Размороженную клубнику положим в полиэтиленовый пакет и добавим туда ананасовый сок (желательно свежий), содержащий большое количество фермента бромелина. Этот фермент является протеазой (протеиназой), то есть способен разрушать белки. От белков нам желательно избавиться, потому что некоторые из них могут разрушать ДНК. Концентрированная протеаза из ананаса используется для удаления омертвевшей ткани после сильных ожогов, а также для маринования мяса на шашлыки (мясо становится более мягким). Есть предположение, что ананасовый сок благодаря столь высокому содержанию протеаз улучшает пищеварение.

Содержимое пакета нужно как следует перемешать и размять, чтобы ДНК оказалась в растворе. От мякоти придется избавиться — для этого можно использовать марлю или дуршлаг. Жидкость, отфильтрованную от мякоти, переливаем в стакан и достаем очень крепкий алкоголь. <...> Желательно, чтобы в нем было больше 70% спирта. Внимание! Чрезмерное употребление алкоголя вредит вашему здоровью!

Алкоголь нужно добавлять в коктейль очень медленно, по краешку стакана. Желательная высота слоя спирта — несколько сантиметров. Ни в коем случае спирт не должен перемешиваться с соком. В спирте ДНК не растворяется, поэтому, если все сделать аккуратно, получится двухслойный напиток, а между слоями сформируются беловатые сгустки ДНК. 

Конечно, в лаборатории используют гораздо более стандартизованные и эффективные методы выделения ДНК. Быструю заморозку клеток можно осуществлять в жидком азоте. Кроме того, для разрушения клеточных оболочек можно использовать детергент (вроде моющего средства), например раствор Triton X-100. В детергент иногда добавляют соль, которая помогает ДНК слипаться. Вместо протеаз из ананасового сока для разрушения белков используют чистую протеиназу (чаще всего протеиназу К). Вместо дорогих алкогольных напитков берут обычный спирт. После добавления спирта раствор обычно охлаждают и помещают в центрифугу, где пробирка начинает вращаться со скоростью около десяти тысяч оборотов в минуту. Центробежная сила приводит к тому, что осадок (из ДНК) оказывается на дне пробирки. Потом жидкость из пробирки удаляется, а ДНК так и остается на дне. Подобные эксперименты в ряде стран проводят даже дети. Когда они подрастут, им разрешат использовать методы выделения ДНК для взрослых — с Bacardi и абсентом.

С генной инженерией не все так просто, как с выделением ДНК. Вам потребуется объект, который вы хотите модифицировать, например бактерия или растение, один из множества инструментов для генной модификации и, собственно, та конструкция из ДНК, которую вы хотите перенести. В качестве примера попробуем создать флуоресцирующую бактерию. Доктор М, а также другие ученые до него уже нашли для нас гены, которые кодируют флуоресцентные белки, и выложили их последовательности нуклеотидов в открытые базы данных, что существенно облегчает поставленную перед нами задачу.

В 1961 году японский ученый Осаму Симомура выделил из медузы рода Aequorea красивый биолюминесцентный белок, светящийся синим. Позже было установлено, что у медузы есть еще один белок, работающий с ним в паре. Мы его уже упоминали в предыдущих главах. Этот белок поглощает свет в синем диапазоне, а излучает в зеленом. Его назвали GFP (green fluorescent protein, или зеленый флуоресцентный белок). Если биолюминесцентный белкам нужен исходный продукт (субстрат), с которым они вступают в химическую реакцию для получения света, то GFP в таком субстрате не нуждается. Как это часто бывает в области фундаментальных научных исследований, в последующие тридцать лет GFP оставался практически бесполезным и интересовал лишь узких специалистов, изучающих механизмы его флуоресценции. До тех пор, пока внезапно этому белку не нашлось важнейшее применение, перевернувшее наши представления о молекулярной биологии.

В 1992 году американский ученый Дуглас Прэшер с соавторами установили последовательность гена GFP. К сожалению, ученому самым обидным образом не хватило финансирования, чтобы после продолжить изучение гена. Прэшер едва сводил концы с концами: какое-то время он даже ездил на машине с надписью «ученому нужна работа» и принимал пожертвования. Тем временем геном GFP независимо заинтересовались ученые Мартин Чалфи и Роджер Цянь. Прэшер, полагая, что сам с изучением GFP не справится, согласился передать ген коллегам для проведения дальнейших экспериментов.

Чалфи тоже не купался в деньгах, но обладал изобретательностью, которая очень помогла ему в исследовательской работе. Например, его лаборатория не могла позволить себе флуоресцентный микроскоп (чтобы наблюдать свечение GFP внутри отдельных клеток), поэтому Чалфи приглашал к себе торговцев лабораторным оборудованием, брал у них микроскопы на «испытательный срок», делал нужные снимки и анализы, а потом возвращал приборы обратно, так ничего и не купив.

В 1994 году Чалфи и его коллеги, включая Прэшера, опубликовали в журнале Science статью о том, что с помощью генной инженерии можно соединять ген GFP с другими генами живых организмов, а по свечению определять локализацию кодируемых ими белков. Впоследствии благодаря GFP стало возможно увидеть под микроскопом, как развивается нервная система, как клетки поджелудочной железы, производящие гормон инсулин, организуются в ходе эмбрионального развития, как белки транспортируются в клеточное ядро или из ядра и вообще из одной части клетки в другую, как раковые клетки распространяются по телу человека и так далее.